代謝相關(guān)脂肪性肝�。�MASLD）波及全球超過(guò)30%人口，它不僅已成為導致終末期肝病的主要因素，還與多種慢性、系統性疾�。òò┌Y、心血管疾病和腎功能障礙）密切相關(guān)。MASLD在組織學(xué)上表現為從單純脂肪變性到脂肪性肝炎，再到進(jìn)行性瘢痕形成（即疾病的不同分期）。MASLD的病情發(fā)展過(guò)程極為復雜。目前，阻止其病情進(jìn)展的治療方法效果有限。因此，科學(xué)家們正在能夠早期發(fā)現脂肪變性的生物標志物，為預防MASLD提供更加科學(xué)的依據。盡管缺乏組織活檢這一參考金標準，但通過(guò)大型隊列研究和先進(jìn)的成像技術(shù)，以及血液中的基因組和非基因組生物標志物，已經(jīng)發(fā)現了一些有潛力的早期生物標志物，如PNPLA3。然而，單憑基因變異并不能完全解釋行為和環(huán)境因素（如飲食、肥胖和糖尿�。⿲χ咀冃缘挠绊�。這些因素在更接近脂肪變性的其他分子狀態(tài)中有所體現，如循環(huán)蛋白質(zhì)組學(xué)和肝組織圖譜。此外，肝臟活檢雖然常用于二級護理中檢測已確診的疾病，但在大型研究中，這種方法針對高風(fēng)險人群既不道德也不實(shí)際。因此，建立一個(gè)轉化資源庫，將分子洞察力與大型隊列流行病學(xué)、現代肝臟成像技術(shù)以及臨床結果的力量相結合，對于識別預后生物標志物至關(guān)重要。這些生物標志物可能會(huì )成為下游機理研究和治療開(kāi)發(fā)的目標。
在這項研究中，科學(xué)家們的目標是建立一個(gè)轉化醫學(xué)資源庫，用于研究人類(lèi)的代謝相關(guān)脂肪肝疾�。∕ASLD）。他們通過(guò)分析大量人群的臨床蛋白質(zhì)組數據，并結合非侵入性測量肝臟脂肪變性的方法和肝臟組織的動(dòng)態(tài)變化，試圖找到與MASLD相關(guān)的循環(huán)蛋白質(zhì)。研究團隊通過(guò)利用三個(gè)大型、前瞻性、跨國隊列（≈5,000人），覆蓋了廣泛的代謝風(fēng)險人群，使用不同的非侵入性方法來(lái)測量肝臟脂肪變性，并識別出與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)。他們評估了這些肝臟脂肪變性相關(guān)的蛋白質(zhì)組特征在更大規模樣本（超過(guò)26,000人）中對MASLD預后和相關(guān)臨床結果的影響。為了更深入理解這些生物標志物并增強其組織特異性，科學(xué)家們使用了肝臟芯片模型來(lái)監測肝臟脂肪變性過(guò)程中細胞特異性轉錄和蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。他們的最終目的是驗證一種整合循環(huán)蛋白質(zhì)組、組織轉錄組和蛋白質(zhì)組以及人體模型的方法，是否能在人體肝臟的動(dòng)態(tài)代謝過(guò)程中找到生理上合理的靶點(diǎn)，以期將臨床生物標志物的發(fā)現與肝臟的生物學(xué)緊密聯(lián)系起來(lái)。
本研究包括6個(gè)步驟，具體包括：（1）識別并驗證與“肝脂肪變性”相關(guān)的蛋白質(zhì)組（涉及三項前瞻性觀(guān)察研究，共4996名參與者），(2)探究該蛋白質(zhì)組與肝脂肪變性相關(guān)的臨床結果之間的聯(lián)系（對英國生物銀行的26,421名參與者進(jìn)行了長(cháng)達13.7年的中位隨訪(fǎng)），(3)分析組織來(lái)源和相關(guān)分子通路的特性，(4)在完整的MASLD活動(dòng)和階段譜系中，研究編碼肝臟脂肪變性蛋白質(zhì)組的基因在人類(lèi)肝臟中的表達模式，(5)明確這些基因在患有和未患有MASLD的人類(lèi)肝臟中的細胞類(lèi)型和空間分布，(6)在人源化肝臟芯片平臺上進(jìn)行靶標測試，以觀(guān)察轉錄變化是否隨著(zhù)脂肪變性的誘導而發(fā)生，并研究這些變化是否影響蛋白質(zhì)的合成。
整體研究策略圖
總體而言，科學(xué)家們的研究共納入了2,679名CARDIA研究參與者，但排除了那些可能患有繼發(fā)性肝病的參與者、肝功能異常或脂肪變性的潛在次要原因（即非MASLD）。
群體陣列研究基本特征
2、MASLD循環(huán)蛋白質(zhì)組和組織特異性
在對2,679名參與者的SomaScan 7k蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，科學(xué)家們在推導樣本和驗證樣本中識別出與肝衰減相關(guān)的237個(gè)獨特蛋白質(zhì)（肝衰減越低，肝脂肪變性越嚴重）（見(jiàn)圖1A和1B）。研究發(fā)現，流行病學(xué)研究中的蛋白質(zhì)靶標在轉錄水平（圖1C）和組織蛋白質(zhì)組水平（圖1D）上的表達明顯富集，指明了與中央代謝過(guò)程（如碳、丙酮酸、氨基酸、鈣、鎂）有關(guān)的廣泛通路，碳、丙酮酸、氨基酸和碳水化合物代謝和纖維化（圖1E），包括已知和新出現的MASLD機制，例如氨基酸代謝（ACY18,12和FAH13）、酒精加工（如ADH1A14,15）和纖維化（圖1F）、氨基酸代謝（ACY18,12和FAH13）、酒精加工（如 ADH1A14,15）、果糖分解（ALDOB和SORD16）、膽汁酸和類(lèi)固醇代謝（AKR1D117和AKR1C418,19）、糖代謝（FBP120）以及多底物解毒、中間代謝和纖維化（GSTA1,21 ASL,22和UGDH23）等。
為了進(jìn)一步確定 MASLD潛在的核心介導因子，科學(xué)家們進(jìn)行了相互作用（中心基因）分析，找出了與MASLD核心相關(guān)的基因（圖1F）。這些基因涉及肝細胞再生和纖維化調控的致病介質(zhì)（表皮生長(cháng)因子受體25和IGF-126）、細胞凋亡調控（MET27）、炎癥介質(zhì)（CXCL2、28 CRP和SERPINE1）、 肝損傷的細胞外基質(zhì)反應（VTN29和ACAN30）、糖原代謝（PYGL31）和線(xiàn)粒體丙酮酸代謝（PKLR32和 PC33），以及其他一些胰島素敏感性和脂肪堆積的典型標志物（ADIPOQ和 INS）。這些結果表明，循環(huán)中的MASLD蛋白質(zhì)組主要來(lái)源于肝臟，并與肝臟變性中的典型代謝-炎癥-纖維化途徑有關(guān)。
圖1與肝臟脂肪變性有關(guān)的蛋白質(zhì)主要在肝臟中表達，并確定新陳代謝的途徑
科學(xué)家們在對年齡、性別、種族和體重指數進(jìn)行調整后，建立了一個(gè)自適應肝衰減模型（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為 “MASLD評分”）。在推導子樣本和驗證子樣本中，MASLD評分與肝臟衰減顯示出顯著(zhù)的相關(guān)性（Spearmanρ = 0.69和0.56，圖2A），并且當驗證子樣本僅限于符合MASLD臨床標準的參與者時(shí)，MASLD評分依然表現出相似的相關(guān)性�？茖W(xué)家們發(fā)現，體重指數與MASLD評分之間存在一定的相關(guān)性（Spearmanρ = -0.27，p < 2.2× 1016），而年齡、性別、種族和酗酒的影響則相對較小。
接下來(lái)，科學(xué)家們進(jìn)行了研究，以確定MASLD評分是否與臨床結果有相關(guān)性，特別是與心血管疾病、糖尿�。ǜ闻K脂肪變性已知相關(guān)）和MASLD本身的臨床結果。他們分析了英國生物庫（UK Biobank）中26,421名參與者的數據，發(fā)現MASLD評分與MASLD及相關(guān)代謝結果有廣泛的相關(guān)性（圖2D）。研究還表明除了全因死亡率和病因特異性死亡率（尤其是癌癥）之外，MASLD評分（評分越低，脂肪變越多）與慢性非酒精性肝病和糖尿病的發(fā)生油顯著(zhù)關(guān)聯(lián)。即使在考慮了其他可能影響結果的因素（如肝酶AST、ALT和糖尿病指標A1c）后，這些關(guān)聯(lián)依然存在。在心血管和癌癥相關(guān)死亡率方面，競爭風(fēng)險模型（Fine-Gray subdistribution hazard model）提供的估計值與病因特異性模型相似（心血管死亡率HR 0.96，95% CI 0.88-1.06；癌癥死亡率HR 0.90，95% CI 0.84-0.97）。在糖尿病和慢性非酒精性肝病的臨床模型（包括年齡、性別、種族、體重指數、收縮壓、糖尿病[在糖尿病模型中移除]、湯森貧困指數、吸煙、飲酒和低密度脂蛋白）基礎上，加入MASLD評分能顯著(zhù)提升辨別和再分類(lèi)指標（圖2D）。進(jìn)一步調整谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和A1c后，慢性非酒精性肝病的發(fā)病模型也很穩健。
圖2肝脂肪變性蛋白質(zhì)組評分的建立及其與臨床結果的關(guān)系
科學(xué)家們?yōu)榱烁玫乩斫獾鞍踪|(zhì)組分析中識別出的關(guān)鍵蛋白質(zhì)靶點(diǎn)在人體肝臟中的具體位置和分布情況，借助了已有的單細胞RNA測序數據和肝細胞圖譜的空間轉錄組學(xué)數據，將CARDIA臨床蛋白質(zhì)組回歸中確定的蛋白質(zhì)與其在人類(lèi)肝臟中的基因表達進(jìn)行了映射。研究中涉及的樣本不僅包括了空間轉錄組學(xué)數據，還包含了scRNA-seq數據。通過(guò)這些數據，科學(xué)家們能夠廣泛識別細胞類(lèi)型，并根據其與人類(lèi)肝臟內肝臟脂肪變性的關(guān)系確定優(yōu)先靶點(diǎn)的空間分布。科學(xué)家們利用單基因表達量和綜合表達量評分（圖3）對在scRNA-seq和空間轉錄組學(xué)數據集中表達的237個(gè)與脂肪變性相關(guān)的蛋白質(zhì)中的198個(gè)蛋白進(jìn)行了表達譜分析。結果顯示，這一分析表明主要在肝細胞中觀(guān)察到的受牽連靶點(diǎn)的細胞特異性表達模式占主導地位，同時(shí)在成纖維細胞、膽管細胞、內皮細胞和免疫細胞等多種類(lèi)型的細胞中都發(fā)現了靶點(diǎn)的表達（圖3A）。通過(guò)綜合表達評分，科學(xué)家們還發(fā)現，在脂肪變性組織內和肝臟中軸區，相關(guān)靶點(diǎn)的基因活性較高。先前的研究也指出，在該數據集中的這些區域與較高的肝細胞表達特征相對應（圖3B-3F）。
圖3肝脂肪變性蛋白質(zhì)組的轉錄結構
接著(zhù)，科學(xué)家們利用空間轉錄組學(xué)來(lái)檢測蛋白質(zhì)組學(xué)確定的相關(guān)靶點(diǎn)是否會(huì )在肝組織中表現出差異表達。通過(guò)分析，他們發(fā)現，在空間轉錄組學(xué)數據中，與脂肪變性相關(guān)的198個(gè)蛋白-基因中，有33個(gè)基因在健康組織和脂肪變性組織之間表現出顯著(zhù)的差異表達（最小表達量>10%，經(jīng)假發(fā)現率[FDR]調整后p < 0.05；|log2折合變化|>0.25；以及最小表達量%點(diǎn)差異>10%；圖3H）。在這33個(gè)基因中，有30個(gè)基因在脂肪變性組織中表達量增加，3個(gè)基因（IGFBP2、IL1RAP和SHBG）表達量減少。這些基因在有無(wú)脂肪變性的肝臟組織中的呈現出不同的表達模式（圖 3H）。此外，研究還顯示，在人類(lèi)肝臟中，脂肪區與非脂肪區域之間的RNA表達差異與CARDIA研究中循環(huán)蛋白的臨床效應大小之間存在生物學(xué)方向上的一致性（圖3G）。具體來(lái)說(shuō)，CARDIA回歸系數越大，表明健康肝臟區與脂肪肝區的蛋白表達差異越大；脂肪變性程度越低，組織RNA表達量越高。
隨后，科學(xué)家們將這33個(gè)差異表達基因與NASH-CRN定義的肝臟脂肪變性階段的大量轉錄組數據進(jìn)行了比對分析，以研究隨著(zhù)組織病理學(xué)表型嚴重程度逐漸增加的個(gè)體的潛在動(dòng)態(tài)變化（圖4）。研究涉及了499名患有MASLD并接受了活檢的SteatoSITE參與者（其中47%為女性，中位年齡53歲，中位體重指數31 kg/m2，31%患有糖尿�。┡c34份對照樣本進(jìn)行了比較。研究發(fā)現，在這33個(gè)基因中，有12個(gè)基因在所有脂肪變性階段都沒(méi)有顯著(zhù)的表達差異，因此這些基因沒(méi)有被包含在最終的可視化分析圖（圖4）中�？茖W(xué)家們在研究脂肪變性時(shí)發(fā)現，不同的基因在不同脂肪變性等級中的影響程度有顯著(zhù)差異，并且這些發(fā)現與循環(huán)蛋白組學(xué)和空間關(guān)系的研究結果是一致的。例如，IGFBP2、IL1RAP、SHBG、ENO3、DEGB1和ME1，某些基因在不同纖維化階段也表現出一致性。然而，在蛋白質(zhì)組和空間研究中，科學(xué)家們發(fā)現了兩大類(lèi)不一致的現象：一種是某些基因的表達方向與蛋白質(zhì)組空間轉錄結果一致，但與總體轉錄結果不一致（如SERPINE1/PAI-143,44,45和HSPA1B46）；另一種是基因的表達方向與總體轉錄結果一致，但與蛋白質(zhì)組空間轉錄結果不一致（如 PSAT1,47 UDGH,23和 ACO148）。造成這些差異的因素可能包括：技術(shù)因素（測序方法、體細胞與單細胞、先前發(fā)表的scRNA-seq數據集樣本量有限）、參與者水平和生物學(xué)因素（脂肪變性是MASLD表型的一個(gè)組成部分，此外還有炎癥、氣球化和纖維化）。盡管存在這些不一致，這些研究結果還是顯示了蛋白質(zhì)轉錄靶標圖譜在人類(lèi)MASLD中的重要性，而正確繪制這一圖譜需要考慮到上下文的異質(zhì)性以及多種方法整合的復雜性。
圖4不同脂肪變性階段人類(lèi)肝臟空間靶點(diǎn)的轉錄異質(zhì)性
科學(xué)家們?yōu)榱蓑炞C不同肝細胞中脂肪變性相關(guān)基因的轉錄變化與MASLD蛋白體組的直接關(guān)聯(lián)，利用Emulate器官芯片技術(shù)構建了一個(gè)人源化脂肪變性肝臟芯片模型。肝臟芯片研究的實(shí)驗設計如圖5A和5B所示。通過(guò)這個(gè)模型，他們能夠在體外模擬肝臟組織的環(huán)境，并觀(guān)察脂肪變性對肝臟的影響。在給予能夠引起脂肪變性表型的脂肪酸（油酸和棕櫚酸）后，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察、免疫熒光分析和基因表達等方法進(jìn)行研究，結果表明，與形態(tài)學(xué)和轉錄組學(xué)誘導的MASLD表型一致（IRS1、50、51IRS2、51和PPARa52、53減少；SREBP1c、54 PPARg、55和FABP456增加；圖5C和5D）。由于單個(gè)肝臟芯片實(shí)驗中產(chǎn)生的cDNA產(chǎn)量有限，為了更有效地進(jìn)行研究，他們從先前的蛋白質(zhì)組學(xué)和空間轉錄組學(xué)研究中識別出的33個(gè)潛在的靶標中，挑選出了13個(gè)靶標，進(jìn)行進(jìn)一步的評估。這些靶標被評估的方式有兩種：（1）選取了5個(gè)在脂肪變性過(guò)程中表達上調最顯著(zhù)的靶點(diǎn)（HMGCS1、SERPINE1、HSPA1B、ENO3和HSPA1A），以及全部3個(gè)在脂肪變性中下調的靶點(diǎn)（IL1RAP、SHBG和IGFBP2），再加上空間轉錄組學(xué)分析中顯示在脂肪變性中上調幅度最小的2個(gè)靶點(diǎn)（CDA和PYGL）；（2）另外三個(gè)靶標雖然在人類(lèi)肝臟空間研究中表達存在差異，但在非實(shí)質(zhì)性（非肝細胞）細胞（NPCs）中表達顯著(zhù)；它們是ME1、CTSZ和DEFB1。此外，科學(xué)家們還檢測了兩個(gè)肝細胞特異性靶標，這兩個(gè)靶標是從CARDIA中與肝臟脂肪變性相關(guān)的循環(huán)蛋白質(zhì)組中篩選出來(lái)的（ACY1和AKR1C4），且與脂肪變性緊密相關(guān)，并且作為分泌蛋白具有很高的可信度。
圖5肝臟芯片上研究MASLD
在循環(huán)蛋白質(zhì)組、組織轉錄和肝臟芯片實(shí)驗中，科學(xué)家們觀(guān)察到了一致的結果：與肝臟脂質(zhì)代謝、應激反應和非經(jīng)典通路（例如鐵代謝異常）相關(guān)的基因（包括PYGL、HMGCS1、SERPINE1、ENO3和HSPA1B；圖5E）在肝細胞和/或非實(shí)質(zhì)細胞（NPC）中的表達有所增加。盡管在肝臟芯片實(shí)驗中，ME1、CSTZ和DEFB1在肝臟芯片的肝細胞中未見(jiàn)表達（與轉錄組研究一致），但它們在肝臟芯片的NPC中表達卻有所增加（圖5E）。這些發(fā)現與批量轉錄數據中DEFB1和ME1的批量數據（圖4）結果表明：這些基因表達水平的增加可能是由非肝細胞來(lái)源的細胞所引起的。
為了評估在肝臟芯片上誘導脂肪變性是否會(huì )導致這些靶標在蛋白質(zhì)水平上的表達增加，科學(xué)家們隨后測量了在肝臟芯片上唯一可接觸到的肝細胞和NPC流出物中的靶標。他們選擇了在肝臟芯片實(shí)驗中15個(gè)在肝細胞中mRNA水平差異表達基因中的7個(gè)，這些基因具有細胞外分泌的高可信度細胞蛋白靶點(diǎn)，并且具有可用于評估肝臟芯片實(shí)驗流出物的商業(yè)ELISA試劑盒（HMGCS1、SERPINE1、PYGL、CTSZ、DEFB1、ACY1和AKR1C4；圖5）�？茖W(xué)家們注意到，在肝臟芯片的細胞流出物中，HMGCS1、SERPINE1、CTSZ、DEFB1、PYGL、ACY1和 AKR1C4的蛋白質(zhì)水平表達一致（圖5F），這表明細胞類(lèi)型特異性蛋白質(zhì)分泌與肝臟芯片上的轉錄變化和群體水平的蛋白質(zhì)組方向性相匹配。有趣的是，轉錄組數據中非肝細胞特異基因編碼的分泌蛋白（并在科學(xué)家們的肝臟芯片數據中的mRNA表達水平上得到驗證）僅在非肝細胞的流出液中檢測到（CTSZ和DEFB1）。相反，僅在肝細胞通道中檢測到肝細胞特異性蛋白（ACY1和AKR1C4）。
肝脂肪變性是多系統代謝功能障礙的核心表型，隨著(zhù)肥胖癥的流行而日益嚴重�？茖W(xué)家們采用一種綜合臨床表型、循環(huán)蛋白質(zhì)組學(xué)和組織轉錄組學(xué)的轉化策略，來(lái)尋找可以反映肝脂肪變性的動(dòng)態(tài)功能的生物標志物。他們利用多模態(tài)成像和廣泛的蛋白質(zhì)組分析，鑒別出與肝臟脂肪變性進(jìn)展有關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要由在人類(lèi)肝臟中轉錄水平豐富的基因編碼。在空間轉錄組學(xué)研究中，這些轉錄本在不同的脂肪變性區域有不同的表達模式，其中一些在脂肪變性階段是動(dòng)態(tài)的。脂肪變性的循環(huán)多蛋白特征與脂肪肝和多系統代謝結果密切相關(guān)。科學(xué)家們利用人源化肝臟芯片模型誘導肝脂肪變性，驗證了優(yōu)先靶點(diǎn)的細胞特異性表達。這些發(fā)現凸顯了該方法在評估人類(lèi)肝臟的預后、功能以及動(dòng)態(tài)“液體活檢 ”方面的實(shí)用性，為尋找新的生物標志物和機理研究開(kāi)辟了新的途徑提供新思路。
