Cedars-Sinai案例 | 腦芯片增強iPSC分化的多巴胺能神經(jīng)元成熟

很高興與大家分享Cedars-Sinai醫學(xué)中心Clive N.Svendsen教授團隊在<International Journal of Molecular Sciences>上發(fā)表的一篇論文。該論文基于Emulate器官芯片技術(shù)重建腦芯片，發(fā)現在生物力學(xué)刺激下，腦芯片上培養的多巴胺能神經(jīng)元的比例更高、更均勻，成熟標志物的水平也更高。它是研究成熟多巴胺能神經(jīng)元的理想平臺，可以更好地了解它們在健康和神經(jīng)系統疾病中的生物學(xué)特征。

背景簡(jiǎn)介：

人類(lèi)誘導多能干細胞（iPSCs）為更好地理解人類(lèi)生物學(xué)提供了一個(gè)強大的平臺，來(lái)自患者的iPSCs也可用于忠實(shí)的疾病建模。然而，傳統的二維培養模型缺乏體內三維多細胞復雜性。為了使多能干細胞產(chǎn)生與健康和疾病中發(fā)現的細胞相似的成熟細胞表型，可能需要使用三維系統，如類(lèi)器官和微流控器官芯片平臺。

生物相容性材料和微工程技術(shù)的結合使微流體器官芯片的發(fā)展成為可能。器官芯片的設計目的是在一個(gè)完全集成的系統中生長(cháng)多種器官特異性細胞類(lèi)型。不同類(lèi)型的細胞通常在由含有微通道的多孔膜連接的兩個(gè)獨立隔室中培養。由于人體不是一個(gè)靜態(tài)系統，而是由流動(dòng)的血管灌注的，因此器官芯片比二維培養具有更多優(yōu)勢，因為它們允許液體在細胞之間流動(dòng)。

多巴胺能神經(jīng)元在自主運動(dòng)和各種行為過(guò)程中起著(zhù)至關(guān)重要的作用，如情緒、獎勵和成癮。此外，多巴胺的變化也是各種神經(jīng)系統疾病的基礎，如注意力缺陷障礙、精神分裂癥和帕金森�。≒D）。盡管人類(lèi)多巴胺能神經(jīng)元已在二維平臺上廣泛培養，但這些神經(jīng)元可能還不夠成熟，無(wú)法忠實(shí)地再現健康和患病狀態(tài)。在這項研究中，科學(xué)家們將人類(lèi)iPSC分化為多巴胺能神經(jīng)元，并將傳統的二維培養系統與Emulate器官芯片系統進(jìn)行了比較�；�于免疫熒光和單核RNA測序（snRNA-seq），科學(xué)家們發(fā)現，Emulate器官芯片平臺可以提高培養中多巴胺能神經(jīng)元的成熟度和均勻性。人類(lèi)iPSC衍生的多巴胺能神經(jīng)元器官芯片的開(kāi)發(fā)可以為該領(lǐng)域提供成熟的多巴胺能神經(jīng)細胞，從而更好地了解它們在健康和疾病中的生物學(xué)特性。

1、星形膠質(zhì)細胞可提高多巴胺能神經(jīng)元的存活率 

為了確定多巴胺能神經(jīng)元在傳統二維Transwell模型或器官芯片培養物中的存活情況，科學(xué)家將人類(lèi)iPSC分化為多巴胺能神經(jīng)元祖細胞15天，然后收集并低溫儲存，直到隨后解凍并接種到傳統二維Transwell模型的玻璃蓋玻片或Emulate器官芯片的頂部通道上。細胞儲存在成熟的神經(jīng)元培養基中。傳統的二維Transwell模型培養基每?jì)商旄鼡Q一次，而器官芯片培養基以20µL/h的恒定速率運行。第28天，將樣品固定用于免疫細胞化學(xué)分析或snRNA-seq分析（圖1A）。

圖1. 人類(lèi) iPSCs 可分化為多巴胺能神經(jīng)元

在傳統的二維Transwell模型和器官芯片中，活細胞的相位圖像顯示了許多團塊。免疫熒光顯示酪氨酸羥化酶（TH）陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元的分布不均勻（圖1B，C）。眾所周知，星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元的成熟和穩定性中起著(zhù)重要作用，因此科學(xué)家將多巴胺能神經(jīng)元祖細胞與從中腦分離的商用原代人類(lèi)星形膠質(zhì)細胞共培養。TH和神經(jīng)元標記物MAP2ab的個(gè)體TH免疫組織化學(xué)分析和共染色表明，與星形膠質(zhì)細胞共培養的多巴胺能神經(jīng)元在整個(gè)二維孔培養和器官芯片中分布更均勻，纖維生長(cháng)增加（圖1B、C、D）。定量分析顯示，與不含星形膠質(zhì)細胞的共培養相比，與星形膠質(zhì)細胞共培養的TH陽(yáng)性細胞總數顯著(zhù)增加，并呈上升趨勢。為了量化培養物隨時(shí)間的健康狀況，進(jìn)行了乳酸脫氫酶（LDH）檢測，結果表明，與早期時(shí)間點(diǎn)相比，傳統的二維Transwell模型在第28天的細胞死亡比Emulate器官芯片培養顯著(zhù)增加（圖1G）。 

令人驚訝的是，盡管在實(shí)驗開(kāi)始時(shí)接種了星形膠質(zhì)細胞，但在第28天只觀(guān)察到極少數膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）陽(yáng)性星形膠質(zhì)細胞�？茖W(xué)家推測，星形膠質(zhì)細胞未能存活是由于使用了含有有絲分裂抑制劑DAPT和缺乏血清的神經(jīng)元成熟培養基。為了進(jìn)一步研究這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家們在專(zhuān)門(mén)針對星形膠質(zhì)細胞的二維Transwell培養基或成熟神經(jīng)元培養基中培養原代星形膠質(zhì)細胞，并將其維持28天。在星形膠質(zhì)細胞培養基中，GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細胞存活，而在神經(jīng)元培養基中雖然也有一些GFAP陰性和DAPI染色的細胞，但存活率大大降低。為了評估星形膠質(zhì)細胞過(guò)度死亡的情況，將星形膠質(zhì)細胞分別儲存在神經(jīng)元培養基中并進(jìn)行LDH檢測。結果顯示，28天后星形膠質(zhì)細胞死亡顯著(zhù)增加。由于神經(jīng)元培養基中原代星形膠質(zhì)細胞明顯逐漸死亡，剩余的GFAP陰性細胞可能反映了其他類(lèi)型的細胞，因為市面上可獲得的星形膠質(zhì)細胞尚未進(jìn)行純度分類(lèi)。然而，鑒于共培養中星形膠質(zhì)細胞的比例已經(jīng)稀釋?zhuān)�預計這種細胞亞群的數量不會(huì )太多。

2、與傳統Transwell模型相比，Emulate器官芯片培養的多巴胺能神經(jīng)元更佳

為了進(jìn)一步表征和量化傳統Transwell模型和器官芯片中的多巴胺能神經(jīng)元，科學(xué)家們用星形膠質(zhì)細胞生成了一組用于snRNA-seq的多巴胺能神經(jīng)細胞培養物。經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾后，科學(xué)家分析了所有培養物中的5538個(gè)細胞核（傳統Transwell模型中為3548個(gè)，器官芯片培養物中為1990個(gè)），平均每個(gè)細胞核檢測到11156個(gè)讀數和4227個(gè)基因。共鑒定出六個(gè)不同的基因簇（圖2A）。正如預期的那樣，在分化培養中幾乎檢測不到多能標記物（POU5F1、NANOG和KLF4）的表達（圖2B）。在細胞簇2中發(fā)現了一些基于增殖標記MKI67、TOP2A和CENPF的分裂細胞（圖2B）。僅檢測到少量表達AQP4、S100B或GFAP的細胞（圖2B），這證實(shí)了GFAP染色的缺失，并進(jìn)一步表明星形膠質(zhì)細胞可能無(wú)法在器官芯片中存活到終點(diǎn)。最后，為了進(jìn)一步分析細胞身份，根據特定細胞類(lèi)型標記的表達將細胞簇分為祖細胞和神經(jīng)細胞身份（圖2C）。多巴胺能祖細胞標志物SOX6、HES1和NFIA的表達鑒定了三個(gè)祖細胞群，而神經(jīng)元成熟標志物RBFOX3、MAPT和SNAP25的表達鑒定出三個(gè)神經(jīng)元群。

圖2. 不同簇間多巴胺能神經(jīng)元的不同亞型

為了分別評估傳統Transwell模型和器官芯片中的神經(jīng)元數量（圖2D左），使用計算出的細胞總數中每個(gè)細胞群中的細胞數量來(lái)量化每個(gè)細胞群的比例（圖2D右）。結果表明，器官芯片具有獨特的祖細胞和神經(jīng)元群。盡管細胞簇1和3的比例存在一些差異，但二維孔和器官芯片祖細胞之間的主要差異出現在細胞簇2中（二維孔0.5%，器官芯片30%），該細胞簇顯示了底物標記CORIN1、LMX1A和FOXA2的最大組合。這表明器官芯片環(huán)境正在推動(dòng)細胞走向多巴胺能命運發(fā)展。小鼠胚胎的單細胞RNA-seq分析表明，兩組多巴胺能祖細胞表達相同的標記物（LMX1A/B、OTX2、NR4A2），其中一個(gè)群體產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元，另一個(gè)群體產(chǎn)生眼下核（STN）的谷氨酸能神經(jīng)元。因此，科學(xué)家們評估了STN標記物（BARLH1、DBX1、WNT8B和PITX2）的表達，發(fā)現與多巴胺能標記物相比，在傳統的Transwell模型或器官芯片培養中幾乎檢測不到轉錄水平。由于這些培養物中顯示了多巴胺能祖細胞的表達標記，科學(xué)家隨后量化了TH的表達（顏色強度）和每個(gè)細胞群中表達TH的細胞百分比（圖2E）。結果顯示，第5組約30%的細胞表達TH，第6組約20%的細胞表達TH。綜上所述，這些數據表明，盡管二維孔培養中的神經(jīng)元總數較多，但器官芯片中表達TH的神經(jīng)元比例最高。然后，科學(xué)家們評估了不同培養物中細胞的總體表達（圖3A）。由于傳統孔平臺產(chǎn)生了大量的神經(jīng)元，但表達TH的神經(jīng)元比例很小，科學(xué)家們希望研究這些神經(jīng)元的特性。因此，科學(xué)家們評估了神經(jīng)元標志物的基因表達水平，如膽堿能乙酰轉移酶（CHAT，膽堿能神經(jīng)元）、生長(cháng)抑素（SST，抑制性神經(jīng)元）、谷氨酸脫羧酶（GAD1，抑制性神經(jīng)細胞）、TPH1和TPH2（5-羥色胺能神經(jīng)元）以及SLC17A7和SLC17A8（谷氨酸能神經(jīng)元）。抑制性神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元的基因在傳統的Transwell模型和器官芯片培養物中分布在各種簇中，而CHAT和SST在二維孔系統的群組6中高度富集（圖3B）。總之，這些發(fā)現表明，盡管傳統孔培養中神經(jīng)元細胞的總體水平很高，但它們的特異性很低，其中大多數似乎是膽堿能細胞而不是多巴胺能細胞。

圖3. 器官芯片與二維孔培養相比，多巴胺能神經(jīng)元的比例和均勻性更高

進(jìn)一步評估5組和6組之間的成熟標志物顯示，與第5組（富集于器官芯片上）相比，第6組（富集于二維孔）神經(jīng)祖細胞標記物Nestin（NES）和未成熟神經(jīng)元標記物Doublecortin（DCX）的表達水平更高（圖3C）。相比之下，第5組神經(jīng)元成熟標志物DLG4、MAP2和RBFOX3的基因表達增加，而SYP在培養間保持穩定。比較TH陽(yáng)性神經(jīng)元總數的比例，發(fā)現器官芯片中TH陽(yáng)性神經(jīng)元的比例（12%）是二維孔系統中TH陽(yáng)性神經(jīng)元的比例（6%）的兩倍（圖3D）。科學(xué)家們接下來(lái)評估了TH與主要多巴胺能標記物的共同表達。雖然表達鉀內向整流通道J亞家族成員6（KCNJ6）的TH陽(yáng)性神經(jīng)元比例在二維孔和器官芯片培養中相似（二維孔46.5% VS 器官芯片53.8%），但在器官芯片培養中表達SOX6的TH陽(yáng)性細胞更多（二維孔13.4% VS 器官芯片40.75%），LMO3（二維 孔18.5% VS 器官芯片37.4%）和 NR4A2（二維孔9.91% VS 器官芯片26.9%）。這表明與傳統的孔培養相比，器官芯片中的多巴胺能神經(jīng)元中幾種典型的A9多巴胺能標記物的表達升高（圖3E）。最后，利用火山圖分析評估5組和6組與所有細胞相比差異表達的標記物。群組6主要代表來(lái)自傳統Transwell模型的細胞，包括非TH特異性神經(jīng)元基因，如ISL1和NEFM（圖3F），顯著(zhù)升高的基因支持傳統Transwell模型中TH神經(jīng)元共表達基因的研究結果。群組5（主要代表來(lái)自器官芯片的細胞）的群體標記包括TH相關(guān)的發(fā)育基因，如LMX1A或轉錄因子TMEFF2, TMEFF2此前已被確定為中腦神經(jīng)元存活因子（圖3G）。這些綜合結果表明，器官芯片產(chǎn)生的多巴胺能神經(jīng)元比例更高、更均勻。

3、討論

人類(lèi)多能干細胞可以分化成人體內的任何組織，但為了準確研究健康和疾病中的細胞生物學(xué)，需要成熟的細胞表型。雖然iPSC衍生的二維培養長(cháng)期以來(lái)一直被使用，但這種平臺往往缺乏相關(guān)的多細胞復雜性和忠實(shí)的細胞成熟。相比之下，3D細胞培養模型能夠更好地重現微環(huán)境，并提供優(yōu)化的細胞成熟。鑒于多巴胺能神經(jīng)元在成人中樞神經(jīng)系統中起著(zhù)許多關(guān)鍵作用，并且多巴胺的變化是各種神經(jīng)系統疾病的基礎，開(kāi)發(fā)成熟多巴胺能神經(jīng)元的體外培養系統可能有助于更好地了解它們在健康和疾病中的作用。

這項研究將科學(xué)家發(fā)表的在二維孔平臺上生成多巴胺能神經(jīng)元的方案與器官芯片系統進(jìn)行了比較。現在科學(xué)家們已經(jīng)證明，與傳統的二維孔培養相比，新型多巴胺能神經(jīng)元器官芯片能提供更成熟、更均勻的多巴胺能神經(jīng)元群。通過(guò)與人類(lèi)星形膠質(zhì)細胞的初始共培養，克服了神經(jīng)元存活率降低的問(wèn)題，這種方法也被其他人用于長(cháng)期培養iPSC衍生的多巴胺能神經(jīng)元。傳統的二維孔培養需要常規更換培養基，與之不同的是，Emulate的器官芯片系統配備了一個(gè)自動(dòng)化的設備系統，可以不斷為細胞提供新鮮的培養物。科學(xué)家們認為，器官芯片平臺通過(guò)持續流動(dòng)的培養基來(lái)補充營(yíng)養物質(zhì)并去除代謝廢物，而不是通過(guò)二維孔培養系統間歇性地提供新鮮培養基來(lái)交換消耗的培養基，這可能是改善細胞整體健康狀況和產(chǎn)生更成熟神經(jīng)元的潛在因素。重要的是，這個(gè)自動(dòng)化系統最終可以讓藥物等化合物通過(guò)芯片，以評估其治療功能和穿越血腦屏障（BBB）的能力。事實(shí)上科學(xué)家們已經(jīng)生成了一個(gè)源自人類(lèi)iPSC的血腦屏障芯片模型，該模型可用于篩選藥物輸送和患者特異性藥物，從而實(shí)現個(gè)性化醫療，或者重建血管神經(jīng)元界面，以模擬疾病中的屏障破壞。

與傳統的Transwell模型相比，器官芯片中的神經(jīng)元數量較少（器官芯片中39%，傳統Transwell模型中54%），而祖細胞數量較多（器官芯片中61%，傳統Transwell模型中46%）。器官芯片中的祖細胞在底板中顯示出高水平的共同表達，已知這些標志物會(huì )產(chǎn)生成熟的多巴胺能神經(jīng)元。這表明器官芯片已經(jīng)準備好分化為多巴胺能神經(jīng)元，并且有更多的TH陽(yáng)性神經(jīng)元。盡管神經(jīng)元群4在二維培養中高度富集，但多巴胺能標記物幾乎沒(méi)有表達。大多數TH陽(yáng)性神經(jīng)元出現在神經(jīng)元群5和6中。然而，第6組（主要包括來(lái)自孔培養物的細胞）也含有額外的神經(jīng)元標記物。相比之下，第5組（主要由器官芯片中的細胞組成，占18%，而二維孔中的細胞僅占1.5%）含有更特異的TH標記。此外，這些特定群體的成熟生物標志物存在一些差異。二維富集的第6組在神經(jīng)祖細胞和未成熟神經(jīng)元中表達較高。相比之下，器官芯片富集的第5組顯示有絲分裂后神經(jīng)元成熟的幾種標記物的表達增加，這在二維孔培養中幾乎不存在。重要的是，在器官芯片中表達TH的神經(jīng)元中，超過(guò)50%同時(shí)表達關(guān)鍵的A9多巴胺能標記KCNJ6和SOX6。此外，器官芯片培養中多巴胺成熟標志物L(fēng)MO3和NR4A2的表達水平是傳統Transwell模型的兩倍。這些發(fā)現共同表明，器官芯片環(huán)境可以產(chǎn)生更多具有A9多巴胺命運的成熟神經(jīng)元。

與傳統的Transwell模型相比，Emulate器官芯片平臺可以?xún)?yōu)化成熟人類(lèi)iPSC衍生多巴胺能神經(jīng)元的生成。此外，器官芯片培養中細胞成熟度的提高已在各種細胞模型中得到證實(shí)。例如，人類(lèi)iPSC衍生的胰腺β細胞表明，胰腺芯片提供了更多與生物學(xué)相關(guān)的細胞來(lái)模擬胰腺疾病，人類(lèi)iPSC衍生的三維心臟細胞培養提高了細胞成熟度。

來(lái)源于患者的iPSC為人類(lèi)疾病提供了一個(gè)強大的體外模型。然而，帕金森病和亨廷頓氏病等晚發(fā)性疾病的iPSC模型很難顯示出穩健的表型。部分原因可能是iPSC衍生的神經(jīng)元還不夠成熟。多巴胺能神經(jīng)元器官芯片不僅提供了更成熟的多巴胺能神經(jīng)元，還為A9多巴胺能神經(jīng)元提供了特異性標記。A9多巴胺能神經(jīng)元是黑質(zhì)中的一種亞型，控制運動(dòng)功能，主要在帕金森病中退化，與腹側被蓋區的A10亞型不同，A10亞型的功能障礙與神經(jīng)和精神疾病有關(guān)。例如，SOX6表達的神經(jīng)元已被證明容易于與帕金森病相關(guān)的變性，并且在多巴胺能神經(jīng)元器官芯片中的富集程度是孔培養的三倍。鑒于存在類(lèi)似于A(yíng)9的成熟多巴胺能神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元器官芯片顯然有可能最終用于建立帕金森病模型和篩選新療法。

目前，科學(xué)家們正在使用來(lái)自患者的iPSC來(lái)生成多巴胺能神經(jīng)元器官芯片，并評估科學(xué)家們在二維孔培養中為年輕發(fā)病的帕金森病患者展示的表型。盡管器官芯片上的多巴胺能神經(jīng)元以前曾被用于建立突觸核蛋白病模型，但這些神經(jīng)元來(lái)自商業(yè)上可獲得的來(lái)源，僅在器官芯片上儲存了8天，并且沒(méi)有進(jìn)行單細胞分析來(lái)比較二維孔和器官芯片條件。科學(xué)家們認為，在恒定流動(dòng)條件下培養來(lái)自人類(lèi)iPSC的多巴胺能神經(jīng)元28天，為帕金森病模型的最終發(fā)展提供了重大進(jìn)展，并為發(fā)現相關(guān)表型提供了理想的平臺。

Emulate器官芯片包含兩個(gè)獨立的通道，允許多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞在一個(gè)通道中共培養，而其他類(lèi)型的細胞可以在另一個(gè)通道中培養，例如參與某些帕金森氏癥癥狀的腎上腺素能神經(jīng)元。帕金森病的一個(gè)重要研究領(lǐng)域是腦-腸軸的作用。目前正在開(kāi)發(fā)的多巴胺神經(jīng)元器官芯片和之前開(kāi)發(fā)的腸道芯片表明，該平臺是研究腦-腸軸在帕金森病中作用的理想平臺，其中每種相關(guān)細胞類(lèi)型都可以在各自的通道中發(fā)揮作用。最后，腦微血管內皮細胞（BMECs）可以在通道中培養，以創(chuàng )建用于研究藥物轉運的人類(lèi)血腦屏障模型。盡管科學(xué)家們尚未研究BMEC與多巴胺能神經(jīng)元之間的關(guān)系，但他們之前已經(jīng)證明，當人類(lèi)iPSC衍生的脊髓神經(jīng)元與BMEC一起在脊髓芯片中培養時(shí)，神經(jīng)元分化和自發(fā)神經(jīng)元活動(dòng)增加，從而更好地模擬肌萎縮性脊髓側索硬化癥等疾病。

總之，器官芯片平臺可以從iPSCs中生成比例更大、更均勻的人類(lèi)多巴胺能神經(jīng)元，提供介質(zhì)流動(dòng)，并能夠在獨立通道中共同培養多種細胞類(lèi)型。憑借這些特性，多巴胺能神經(jīng)元器官芯片是研究多巴胺能神經(jīng)元生物學(xué)的理想選擇，最終可用于模擬多巴胺相關(guān)的神經(jīng)系統疾病，如更好地了解帕金森病和開(kāi)發(fā)新的治療方法。

4、小結

人體細胞在血液供應持續提供營(yíng)養和清除廢物的環(huán)境中運作，而傳統組織培養平臺中的細胞在靜態(tài)培養環(huán)境中生長(cháng)，通常缺乏成熟度，限制了它們在健康和疾病中研究細胞生物學(xué)的實(shí)用性。相比之下，Emulate器官芯片微流控系統允許細胞在更接近體內條件的特定流動(dòng)狀態(tài)下生長(cháng)。在這項研究中，科學(xué)家們將人類(lèi)誘導多能干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元，并評估了傳統Transwell模型和器官芯片模型的細胞特征。科學(xué)家們發(fā)現，與Transwell模型相比，器官芯片培養的多巴胺能神經(jīng)元比例更高、更均勻，以及更高水平的成熟生物標志物。Emulate器官芯片是研究成熟多巴胺能神經(jīng)元的理想平臺，可以更好地了解它們在健康和神經(jīng)系統疾病中的生物學(xué)特性。